11.-  Electroforesis del RNA, Genomico

 

Instituto de Virología - C.I.C.V. - INTA

ELECTROFORESIS DEL RNA  GENOMICO

 

1. INTRODUCCION

 

La electroforesis en geles permite el diagnóstico, caracterización genómica y comparación de aislamientos individuales, por lo que constituye una técnica valiosa para estudios moleculares y epidemiológicos de infecciones a Rotavirus.

 

1.1 Ventajas

 

a) Detección de Rotavirus con una especificidad del 100% (electroferotipo de 11 bandas característico)

 

b) Detección de Rotavirus del grupo A y de otros grupos (B a G),   que presentan una distribución de bandas características y  para los cuales todavía no existen  disponibles kits de diagnóstico inmunológico.

 

c) Discriminación entre Rotavirus, aún de aquellos provenientes de distintas especies.

 

d) Determinación de variaciones genómicas entre Rotavirus provenientes de la misma especie.

 

1.2 Desventajas

 

 Necesidad de equipo específico.

 

2. METODOLOGIA

 

2.1 Extracción del RNA

 

Se resuspende 1 ml de materia fecal en   3 ml de TC Buffer.

 

 Agitar en vortex durante 1 minuto.

 

Clarificar, centrifugando a 2000 r.p.m.    durante 20 minutos a 4ºC.

 

Cuidadosamente remover el sobrenadante y transferirlo a otro tubo.      

 

Agregar 1/10 vol. de solución de SDS al 10%.

 

Agregar 1/30 vol. solución de Acetato de sodio  4M.

 

Agregar   igual   volumen   de mezcla  fenol:cloroformo (3:2).

 

Se agita en vortex durante 1 minuto.

 

Centrifugar a 11.000 r.p.m. durante 10 minutos.

 

Se transfiere la fase acuosa superior a otro tubo evitando tocar la   interfase.

 

Se precipita el RNA agregando 2,5 vol.   de etanol absoluto frío.

 

Se deja precipitar 1 hora a -70ºC o toda  la noche a -20º C.

 

Centrifugar a 11.000 r.p.m. durante 20 minutos a 4ºC.

 

Se descarta el sobrenadante y se dejan secar los pellets, colocando los tubos destapados invertidos sobre papel  absorvente.

 

Resuspender en 400 ul de  buffer de  siembra.

 

La muestra se conserva a -20ºC hasta su corrida  en el gel.

 

 

 

 

 

2.2  Electroforesis  en  geles  de Poliacrilamida

 

Se usará el método descripto por Laemmli (1970) con modificaciones.

 

Armar el sandwich de placas de vidrio dentro de la cual se vertirá la solución a polimerizar empleando separadores de 1,5 mm.

 

Preparar la solución de gel separador según el siguiente protocolo:

 

           

            Gel separador 7,5%

            Agua destilada                                  29.67 ml

            Buffer Tris-HCl pH 8,8                     15.00 ml        

            Solución stock de

            Acrilamida/bis-acrilamida              15.00 ml

            Persulfato de amonio10%                300ul                                                                                    TEMED                                                 30 ul

 

Vertir el gel separador entre las placas de vidrio.

 

Colocar una capa de agua destilada o agua saturada con isobutalnol sobre el gel  para evitar el contacto del mismo  con el oxígeno.

 

Dejar polimerizar durante 1 hora.

 

Descartar el agua saturada con isobutanol y lavar con agua destilada.

 

Preparar  la solución de gel concentrador según el siguiente protocolo:

 

           

            Gel concentrador 3%:

            Agua destilada                     6.30 ml

            Buffer Tris-HCl pH 6,8         2.50 ml                                                         

            Solución stock de

            Acrilamida/bis-acrilamida   1.00ml                                                                                               Persulfato de amonio 10%  100 ul                                                                                                TEMED                                      5  ul

 

Colocar el gel concentrador y el peine evitando la formación de burbujas.

 

Dejar polimerizar durante 45 minutos.

 

Quitar el peine y lavar las calles con buffer de corrida.

 

Colocar el gel en la cuba electroforética y llenar los compartimentos anódico y catódico con buffer de corrida.

 

Sembrar  100 ul de muestra  utilizando micropipeta y tips de electroforesis.

 

Correr a 13 mA durante 17 horas.

 

 

Coloración de geles:

 

            Se utilizará el método de Tinción Argéntica  de Sammons et al (1981)  con       modificaciones.

Se recomienda el empleo de bandeja escrupolosamente lavada y  guantes.

 

Colocar el gel separador en 200 ml de agua.

 

Descartar el agua y colocar 200 ml de solución fijadora.

 

            Dejar actuar durante 30 minutos.

Realizar 2 lavados con agua destilada.

 

Colocar 200 ml de solución de nitrato de plata 0.01 M.

 

            Dejar actuar durante 30 min.-1 hora.

Realizar 4 lavados con agua destilada para eliminar completamente el nitrato de plata.

 

Colocar 100 ml de solución reveladora.

 

Al comenzar a ver claramente las bandas se descarta el revelador  y se lava rápidamente con agua destilada.

 

Detener la reacción con 100 ml de   solución de ácido acético al 10%.

 

Los geles pueden conservarse en una solución de metanol al 45% y ácido acético al 10% en agua destilada o deshidratarse sobre un papel absorvente por calor y vacío.

 

Se aconseja registrar lo antes posible los resultados por fotografiado.

 

 3. BIBLIOGRAFIA

 

1. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of Structural Proteins during the assembly of the head of Bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. 

 

2. Sammons, D. W.; Adam L. D. and Nishizawa, E.E.1981. Ultrsensitive silver-based color staining of peptides  in poliacrilamide gel electroforesis, 2:135-141.

 

3. Herring, A. J.; Inglis, N: F.; Ogeh, C. K.; Snodgrass, D. R. and Menzies, J. D. 1982. Rapid diagnosis of Rotavirus infection by direct detection of viral nucleic acid in silver stained poliacrilamide gels . Journal of Clinical Microbiology, 16(3): 43-477.

 

4. Passini, M. I.; Barrandeguy M. E.; Cornaglia E.; Gottschalk, M.; Gómez Yafal, A.; Fitjman, N. y Schudel, A. A. 1985. Complejos diarreicos neonatales. Manual de técnicas  para la caracterización de agentes infecciosos. Red de Cooperación de Laboratorios Veterinarios de Diagnóstico. FAO.

 

5.Maniatis, T.; Frish E. F.; Sambrook J. 1982. Molecular Cloning A Laboratory Manual - Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor - New York