Curso de Técnicas de Diagnóstico

en Virología Animal

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

13.-  Reactivos y Soluciones

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Instituto de Virología - C.I.C.V. - INTA

REACTIVOS Y SOLUCIONES

 

Buffer carbonato-bicarbonato pH 9,6

 

Na2 CO3                                                        1,59 g  (0,015M)

NaHCO3                                                        2,93 g  (0,035M)

H2O                                                                1 litro

Conservar a 4º C, Estabilidad 14 días.

 

Buffer de lavado pH 7,2

 

NaCI                                                              20,20 g (0,50M)

KH2PO                                                           0,20 g (0,0015M)

Na2HPO4  2H2O                                            1,15 g (0,0065M)

Tween 20

 

Conservar a 4º C. Estabilidad 2 meses.

 

Buffer de dilución pH 7,2

 

Albúmina bovina                                          5 g

Buffer de lavado cps                                     1 litro

Conservar a 4ºC. Estabilidad 7 días.

 

Buffer de ácidos cítrico-fosfato pH 5

 

Acido cítrico H2O                                         7,30 g (0,0347M)

Na2 HPO4 2 H2O                                           11,86g (0,0667M=

H2O csp                                                         1 litro

Conservar a 4º C. Estabilidad 2 meses.

 

Substrato pH 5

 

Ortho-phenyiene diamine,

2HCI                                                              8 mg

Buffer ácido cítrico                                       15 mg

H2O2 30%                                                      5 ul

 

Buffer del gel

 

0,75M Tris pH 8m8

 

Buffer de corrida

 

0,24 M Tris base

1,81 glicina

Se obttiene pH 8,3

 

Buffer de muestra

 

20 mM Tris-CIH pH 7,8

 

Buffer de siembra

 

Azul de bromofenol                                     0,25%

EDTA                                                           

Tris                                                                100 mM

Glicerol                                                          50%

 

Solución stock

 

Acrilamida-bisacrilamida 30:                      0,8%

Persulfato de amonio                                   0,1%

Prepararlo fresco cada vez.

 

Solución reveladora

 

NaOH                                                7,5 g

Formaldehído                                               1,9 ml

H2O csp                                            250 ml

Disolver al NaOH antes de incoporar el formaldehido.

 

Solución 15

 

CI Li                                                   1 M

SDS                                                    2%

EDTA pH 7,8                                    20 mM

 

Buffer pH 6,8

 

0,25 M Tris - CI H pH 6,8

 

Medio de mantenimiento

 

MEMG (Gibco)

Estreptomicina 6,5 mgr/100 ml

Penicilina 10000  Ul/100 ml

(Siniones de Ca y Mg) pH 7,5

 

Hank's solución balanceada

 

CI2Ca (anhidro)                                140 mgr

CLK                                                   400 mgr

PO4KH2                                                 60 mgr

Cl2Mg   6 H2O                                    100 mgr

Mg SO4 H2O                                     100 mgr

ClNa                                                  8000 mgr.

Na2 HPO4. 2 H2O                                   60 mgr

H20 destilada csp                             1 litro

 

PBS

 

Cloruro de Sodio                               8,00 g.

Cloruro de Potasio                            0,20 g.

Fosofato disódico                              1,15 g.

Fosfato dipotásico                             0,20 g.

Agua destilada csp                           1000 ml

Esterilizado de autoclave y consercado a 4º C.

 

Alsever (3x)

 

Citrato de Sodio 5,5 H2O                  33,210 mg

Cloruro de Sodio                               12,600 g

Dextrosa                                            62,500 g

Acido cítrico al 30%                           5,5

Agua destilada csp                           1000 ml

Ajustar el pH con ácido cítrico 30%

Esterilizar por filtro 0,22 u

Para usar, diluir 1 parte de Alsever 3x con 2 partes de H2O bidestilada.

NOTA: Citrato de sodio 2H2O para un litro, usar 27 g.

 

Buffer barbital 5 x

 

Cloruro de Sodio                               83 g.

5,5 Dietilbarbiturato de Sodio          10,19g

Acido Clorhídrico IN                        23 ml

Sol. stock (*)                                        5 ml

Agua destilada csp                       2000 ml

Ajustar pH 7,6 - 7,8

(º)        Solución stock:

            Cloruro de Magnesio            20,33 g

            Cloruro de Calcio 0,03M        4,4   g

            Agua destilada  csp              100  cc

 

Solución salina

 

Cloruro de Sodio                               85 g

H2O destilada csp                          1000 ml

Esterilizar por autoclave y guardar a 4º C

 

PBS pH 7,4

 

Solución A:    Cloruro de Sodio           8,00 g

                        Cloruro de Potasio        0,20 g

                        Fosfato disódico             1,15 g

                        Fosfato dipotasico         0,20 g

                        H2O bidestilada          800 ml

 

Solución B:     Cloruro de Calcio           0,10 mg

                        H20 bidestilada           100      ml

 

Solución C:     Cloruro de Magnesio       0,10  g

                        H20 bidestilada              100      ml

Esterilizar por separador en autoclave.

Mezclar en frío B y C sobre A.

Almacenar a 4º C.

 

Medio de Vallée

 

Fosfato monopotásico                                  0,900 g

Fosfato dipotásico                                         1,130 g

Glicerina                                                     500        ml

Ajustar pH 7,6 con hidróxido de Sodio al 20% (7 ml/l).

Mezclar con H2O destilada 500 ml.

Esterilizar en autoclave y mantener a 4º C.

 

Buffer de borato pH 9,2

 

Hidróxido de Sodio IN                                 45 ml

Acido Bórico                                                    5,6 g

H2O destilada                                                900  ml

 

Hidróxido de Sodio normal

 

Hidróxido de Sodio                                      40 g

H2O bidestilada                                         1000 ml

 

Solución madre de saponina

 

Buffer de borato                                            97,5 ml

Saponina                                                         2,5 g

 

Solución de Richardson

 

Borax 0,4 M                                                  1,53 g

Acido Bórico 0,08M                                      0,49 g

Sorbitol 0,29M                                              5,28 g

Azida sódico 0,06M                                     0,39 g

Disolver en solucuón saturada de cloruro de Sodio y añadir cantidad suficiente para 100 ml.

Guardar a 4ºC.

Combinar 8 partes de complemento con 2 partes de solución de Richrdson.

Mezclar y fraccionar en tubos de hmólisis.

 

Para usar diluir parte de la mezcla de H2O destilada (esta equivale a una dilución 1/10 del complemento y se denomina Solución Madre).

 

P-nitrofenil fosfato

 

1 mg de p-nitrofenil fosfato por ml de buffer de dietonolamina al 10%.

Ditanolamina                                                97 ml

H2O                                                              800 ml

MgCl26H20                                                  100 ml

ClH IM hasta pH 9,8

H2O csp                                                    1000 ml

 

Buffer de Bloqueo (B-PBS-T-B)

 

B-PBS-T 1 X                                                   99 ml

Suero fresco humano                                                 1 ml

 

Buffer de Lavado (B-PBS-T) (10 X)

 

Cloruro de Sodio                                          80 g

Fosfato monopotásico                                    2 g

Fosfato disódico 12 H2O                               29 g

Cloruro de Sodio                                            2 g

Agua destilada csp                                       1000 ml

Bajo agitación permanente agregar 5 ml de Tween 20.

Ajustar a pH 7,4

Para su uso, diluir una parte de PBS-T 10X con 9 partes de agua destilada.

 

O-Fenilendiamina (OPD)

 

Debe preparse inmediatamente ante du usar:

25 mg de OPD se disuelven en 100 ml de buffer citrato-fosfato:

Acido cítrico 0,1M (19,2 g/1)                                  24,3 ml

Fosfato disódico (28,4 g Na2HPO4/1)          25,7 ml

Agua destilada                                             50 ml

Se adiciona 0,05 ml de H2O2 al 30%