2.- Aislamiento Viral

    Inoculación de Cultivos Celulares

    Inoculación de Animales de Laboratorio

Instituto de Virología - C.I.C.V. - INTA

Aislamiento Viral

1.   Inoculación de Cultivos Celulares

Este método de gran sensibilidad para algunos agentes virales, consiste en poner en contacto el material sospechoso con cultivos celulares susceptibles, para que el virus se multiplique y pueda detectarse su presencia por efecto citopático (ECP) u otros métodos  (inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, hemoadsorción, etc.)

1.1.Procesamientos de las muestras

a)   Organos: trozos de 2 x 2 cm. se trituran con tijera y luego se morterean con arena o vidrio molido estéril. Este macerado se resuspende 1/10 p/v en medio de cultivo de mantenimiento celular con antibióticos  (100X) y se centrifuga a 3000 rpm durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante constituye el inóculo para los cultivos.

b)   Hisopados: una vez suspendido el material recogido en medio de cultivo celular con antibióticos (100X) se elimina el hisopo y la suspensión se centrifuga a 3000 rpm durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante se constituye el inóculo para cultivo celular.

c)   Líquidos transcelulares: (cefalorraquídeo, sinovial, etc.) deben centrifugarse a 3000 rpm, durante 20 minutos a 4ºC, utilizándose el sobrenadante como inóculo para cultivo celular.

d)   Sangre: debe emplearse entera aunque puede diluirse 1/10, en medio de cultivo celular a fin de disminuir su citotoxicidad. Si se sospecha de una asociación viral con poblaciones celulares, es conveniente separar la fracción celular y luego inocular el cultivo celular.

e)   Semen: se diluye la pastilla y/o pajuela 1/10 en medio de cultivo celular, y esta solución constituye el inoculo para los cultivos. La toxidad del material seminal determina que luego de un período de adsorción de 60 minutos debe descartarse el inóculo y debe lavarse la monocapa con medio de cultivo celular (3 veces).

f)    Material fecal: se macera y resuspende la materia fecal  en medio de mantenimiento 1/10 p/v. Se clarifica por centreifugación a 5000 rpm, 20 minutos a 4ºC y el sobrenadante se trata con una solución de tripsina (10 ug/ml). 1 hora a 37ºC, inoculando luego el sobrenadante en cultivo celular.

1.2.Inoculación de los cultivos

      Se emplean cultivos en monocapa, primarios o de línea, susceptibles al virus que se desea aislar (ver cuadro 1) con más de un 75% de la superficie cubierta y en envases adecuados. Para este propósito se emplean tubos de Leighton o de ensayo comunes con laminillas de vidrio en su interior ó placas de 24 wells (LABTEK*). Estos cultivos deben estar libres de virus y anticuerpos que interfieran con los virus que se desea investigar. Por ejemplo, es frecuente que los cultivos primarios o de línea puedan estar infectados con cepas no citopatogénicas de BVDV o el suero bovino que se usa en el medio de crecimiento pueda tener anticuerpos y/o virus.

      Seleccionados los cultivos, se procede a :

      Inoculacion de la muestra (1° pasaje) , utilizando no menos de 3 tubos o wells por muestra de material, descartando el medio de crecimiento, se inoculan con 0,2 ml de suspensión problema por tubo o 0,1 ml por cada orificio de placa x 24w. En estas condiciones se incuban a 37ºC durante 45-60 minutos para facilitar la adsorción del virus. Cumplimentado este período se debe volcar el inóculo y realizar 2 lavados con medio de mantenimiento, particularmente en el caso de materiales muy tóxicos para la células como sangre, MF, semen, bazo, hígado, etc. Luego se incorpora 1,8 - 2 ml de medio de mantenimiento celular por tubo o 1ml por cada orificio de la placa y se incuba a 37ºC. Se observan diariamente al microscopio durante 7 días para la detección de ECP. Si no se detecta presencia viral al microscopio, se debe realizar un nuevo pasaje en cultivo celular (pasaje ciego).

      Segundo pasaje: se congela la muestra a –20°C durante 1 (+/-) 1/2 hora y se descongela a 37°C (BDV,IBR)  y de ser necesario se clarificará por centrifugación. Se procede a inocular como en el primer pasaje. Se considera negativo si cumplido el período de incubación de este segundo pasaje (7dias) no se detecta presencia viral , para el caso de IBR, o se hace otro pasaje (3° pas.) en el caso de BVDV.

       Al finalizar el procesamiento de las muestras, se deben realizar los controles en tubo o placa aparte, positivo: se inocula el virus referencia conteniendo 100 DICT 50 y el negativo sin el agregado viral. Considerar que si el control positivo no presenta ECP en el tiempo estimado y/o las celulas del control negativo se presentan anormales o con signos de toxicidad el aislamiento debe ser repetido. 

1.3. Identificación Viral

      Para confirmar la replicación viral y establecer con certeza su identidad, para ello se puede recurrir a varias técnicas que, haciendo uso de reactivos de referencia, sirven para este fin: seroneutralización, fijación de complemento, inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, ELISA o hemoadsorción (descriptas en otros capítulos).

2.     Inoculación de Animales de Laboratorio

      Se inocula animales de laboratorios (ratones, conejos, cobayos, etc.) susceptibles a la infección por el agente viral cuya presencia se sospecha. Este se multiplicará en el hospedador experimental con la producción de diferente sintomatología, hasta en algunos casos puede causarle la muerte.

      Es un método sencillo, sensible y rápido aunque son pocos los virus animales de nuestro interés que poseen huéspedes de laboratorio susceptibles (ver Cuadro 1). No obstante, constituye una importante técnica en la identificación y caracterización de agentes (diagnóstico diferencial).

2.1. Materiales y Métodos

      Procesamiento de la muestra.

      Idem 1.1

2.1.1. Inoculación de Ratón Lactante

a)   Vía Intracerebral: el punto de inoculación es la intersección de dos líneas una que va desde el ojo a  la oreja y la otra perpendicular a esta línea y cortándole por el centro. Se utiliza aguja y jeringa de tuberculina con dosis menor a 0,02 ml.

b)   Vía Intramuscular: se realiza la inoculación en la masa muscular del miembro posterior, aspirando previamente pra asegurarse de no estar en vena. Se utiliza aguja y jeringa similar al anterior.

c)   Vía intraperitoneal: sujetando el animal por la piel de la nuca con el índice y pulgar y con el resto de los dedos por los miembros posteriores  y cola, se lo presenta de cúbito dorsal para inocularlo en un punto del lado derecho y centro del abdomen. Se utiliza aguja y jeringa de tuberculina.

2.1.2. Inoculación de huevos embrionados

      Se seleccionan huevos de planteles libre de infecciones virales, observándolos en un ovoscopio o con iluminación adecuada.

      De acuerdo al agente viral que se sospecha, será la vía de inoculación y por ende, la edad del embrión (ver cuadro 1) a utilizar.

Cuadro 1

Aislamiento viral

Vías de Inoculación

a.   Cavidad Amniótica: el material inoculado ingresará en el embrión vía bucal y respiratoria , pudiéndose multiplicar en cualquier tejido de éste. El embrión debe ser de 10-14 días de edad.  Se desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y allí se perforará con un trócar o taladro adecuado.  Con una aguja de 4,5 cm. de largo, orientada hacia la sombra del embrión se inocula 0,1-0,2 ml de material (Ver figura 1).  Sellar el orificio con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

b.   Membrana corioalantoidea: Usada para virus que producen placas, lesiones herpéticas o tipo pox. Los embriones deben ser de 10-12 días de edad. Se marca el punto de inoculación en el costado del huevo donde se observa buena irrigación de la membrana. Como es necesario hacer caer la membrana para obtener una buena superficie, se desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y el punto de inoculación . Con sumo cuidado se perfora la cáscara y la membrana de la misma en el punto de inoculación y se hace un orificio en la cámara de aire por donde se succiona con una perilla de goma para que se produzca una falsa cámara de aire. Allí se depositará el inóculo de 0,1 - 0,2 ml con jeringa y aguja de tuberculina (ver figura 1). Sellar los orificios con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

c.   Cavidad alantoidea: el virus se difundirá en el fluido e infectará las células ectodérmicas de la membrana. Se utilizan embriones de 10-11 días de edad, Observándose el ovoscopio, se marca en el extremo de la camara de aire, el punto de inoculación que debe ser opuesto a la ubicaicón del embrión y con pocos vasos sanguíneos. Se desinfecta y se perfora la cáscara en dicho punto, inoculando (0,1-0,2  ml) con una aguja de 1,5 cm de largo que se introduce paralela a la pared del huevo (ver figura 2). Se sella con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

d.   Saco vitelino: se emplean embriones de 8-12 días de edad con gran saco vitelino, Se desinfecta el extremo de la cámara de aire y se perfora la cáscara. Con una aguja en línea recta (0,1 - 0,2 ml.) (ver figura 2). Se sella con parafina líquida u otro sellador no tóxico.

e.   Endovenosa: se emplean embriones de 8-12 días de edad. Observándose  al ovoscopio se selecciona una vena de buen grosor y que se dirija hacia el embrión. Se dibuja en la cáscara su ubicación. Usando un taladro adecuado se marca  un rectángulo, enmarcando la vena y que sólo interese la cáscara, sin romper la membrana que se encuentra por debajo de ésta. Se desinfecta la zona y con una aguja bien fina se inocula (debe observarse cómo el inóculo al diluir la sangre, circula por la vena). Ver figura 2. Se sella con parafina fundida u otro sellador no tóxico.

Bibliografía

Proceeding of 75th. Annual Meeting U.S. Animal Health Association, 1971

"Recommended Standard Laboratory Techniques for diagnosing infectious bovino rhinotracheitis. Bovine virus diarrhea and Shipping fever (Parainfluenza-3)".

Edwin H. Lennette, Nathalie J. Schmidt. "Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial Disease". Third Edition.