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Curso de Técnicas
de Diagnóstico en Virología
Animal |
3.- Técnicas Inmunohistoquímicas
Inmunofluorescencia
Inmunoperoxidasa
Instituto de Virología - C.I.C.V. - INTA
TECNICAS
INMUNOHISTOQUIMICAS
INTRODUCCION
Inmunofluorescencia
Una
reacción inmunológica del tipo de unión antígeno- anticuerpo puede ser puesta
en evidencia por la emisión de fluorescencia si se utiliza en ella anticuerpos
unidos a radicales orgánicos con propiedades fluorescentes y se hace uso de un
microscopio de fluorescencia para visualizarla.
Dicha
fluorescencia consiste en la propiedad de ciertas sustancias, denominadas
fluorocromos, de emitir luz de mayor longitud de onda de la que reciben
mientras dura la excitación con la luz incidente.
Ventajas de la técnica
-Extraordinaria
sensibilidad a la comprobación óptica: a la luz común, las soluciones
cromáticas se aprecian coloreadas hasta diluciones de 1:100.000, sin
embargo,las sustancias fluorescentes todavia son suceptibles de determinarse
por su fluorescencia en una dilución de alrededor de 1:1.000.000. Permite
localizar con precisión el antígeno en concentraciones de 10 ugr/ml.
-Rápida
y sencilla de realizar, ya contando con el equipo es de bajo costo.
-Se
puede utilizar para ubicar antígenos en órganos que poseen mucha contaminación
o virus no viables y que por ende no se pueden multiplicar.
-Pueden
ser demostrados antígenos intracelulares.
Desventajas
-Equipo
costoso
METODOS
-Directo (IFD)
Procedimiento
original de Coons y col., se aplica una solución de anticuerpos específicos
marcados con el fluorocromo, sobre la preparación que posee el antígeno.
Así se forma un complejo antígeno-anticuerpo
marcado .
-Indirecto (IFI)
La
preparación que contiene el antígeno se enfrenta con el anticuerpo no marcado y
este complejo se visualiza aplicándole antigama-globulina marcada con el
fluorocromo.
Esta
técnica se utiliza para identificar y localizar antígenos y para detectar y
titular anticuerpos .
Es más sensible que el método indirecto pero
incrementa la posibilidad de reacciones inespecíficas.
Dentro
de este método podríamos incluir la tinción del complemento (ideada por
Goldwasser y Shepard) en la que se hace participar al complemento y luego se
visualiza con un suero anticomplemento de cobayo marcado, los autores indican
que es más sensible.Se utilizó con exito en Rabia
-Competición (IFC)
Fue
utilizado por Goldman para toxoplasmosis y consiste en mezclar el suero
incognita con el antisuero conocido marcado y esto se enfrenta al antígeno, la
disminución de la fluorescencia indica la presencia de anticuerpos en el suero
problema que compitieron con el marcado.
PREPARACION
DEL ANTIGENO
1) En trozos de tejidos (cuadro 1)
Peste
Porcina Clásica (PPC): Bazo ,tonsila, linfonódulos mesentéricos y hepatogástricos,
hígado, riñon y pulmón.
Peste Porcina Africana (PPA): idem PPC
Rinotraqueitis
infecciosa bovina (IBR): tejidos fetales (riñon, higado, bazo, pulmón), mucosa
nasal, traqueal, pulmón.
Vulvovaginitis-Balanopostitis
inf. bov.: hisopados o trozos de mucosa de vulva-vagina o prepucial.
Enfermedad
de las Mucosas-Diarrea vírica ( BVDV): Mucosa intestinal y esofágica,
linfonódulos, bazo y médula ósea.
Parainfluenza-3
(PI-3):Mucosa nasal y pulmón.
a)Cortes por congelación
Se secciona un trozo de órgano del tejido de 1x1cm y se monta en un taco del micrótomo, con un
congelante o agua.
Se
coloca a congelar a -20ºC en el micrótomo junto con la cuchilla.
Se
realizan los cortes (PPA: 4-8u (espesor), PPC: 5u, IBR,BVDV y PI-3 :6-8u).
Se seleccionan los cortes y se adhiren por contacto en un
portaobjetos limpio y desengrasado a temperatura ambiente.
Se rotula y se fijan en acetona a -20ºC 10 min. Se secan
al aire y se pueden colorear o guardar
a -20ºC en recipientes herméticos.
b)Improntas
Se realizan dos toques de la superficie del trozo de tejido con un portaobjeto limpio y
desengrasado. Se rotula y se fija en acetona a -20ºC 10 min.Se secan al aire y
se pueden colorear o guardar a -20ºC en recipientes herméticos
2) En cultivos celulares
A. En
monocapa celular producida en laminillas de tubo Leigthon o en chambers (Lab
Tek*).Estas monocapas pueden ser de cultivos celulares primarios o de líneas
(cuadro 1aislamiento viral). Se inocula el cultivo con el virus o material de
diagnóstico.Cuando aparace el ECP o al cabo de la incubación (4-5 días) se
descarta el sobrenadante se lavan las laminillas o chambers con PBS y se fijan
en acetona a -20ºC 10 min. Secar al
aire y guardar en recipiente hermético a -20ºC. *Nunc cat. 178599
B. En
suspesión (método del spot o gota): Preparar una suspensión de células
infectadas y otra de células sin infectar. Lavarlas tres veces con PBS .
Realizar el recuento y ajustar las concentraciones de modo tal
de obtener una mezcla final que contenga 65% de células. sin infectar y 35% de
infectadas y no más de 400.000 células/ml. Colocar una gota de la suspensión en
cada orificio de portaobjetos para fluorescencia. Secar y fijar en acetona a
-20ºC 10 min.Secar al aire y guardar en recipiente hermético a -20ºC.
-PREPARACION DE ANTICUERPOS
Sueros no marcados
para el método indirecto (detección de
AC):
Se
utiliza el suero problema diluido 1/5 en PBS y en caso de querer titularlo se
hacen diluciones en base dos.
Sueros marcados para
el método directo (detección de AG):
Los fluorocromos más utilizados en la actualidad son:
Isotiocianato de fluoresceina:estable, se combina con los
grupos amino de las proteínas por uniones carbamido. Es excitado por la luz
azul de 490nm de long.de onda y emite fluorescencia color verde manzana de
520nm de long. de onda.
Isotiocianato de tertametil rodamina: se une a los grupos amino
de las proteínas por grupos tiocarbamidas,es excitado por luz verde de 540nm de
long. de onda y emite fluorescencia roja anaranjada de 570nm de long. de onda.
Se ha comprobado que el ojo humano es más sensible al verde que
al anaranjado y la autofluorescencia roja es más común, por lo que se usa más el isotiocianato de
fluoresceina.
Procedimiento de
marcado:
Se precipitan las
gamaglobulinas con sulfato de amonio.
Se centrifugan y
lavan con agua destilada.
Se repiten estos dos
pasos.
Se resuspende el
sedimento en buffer tris HCl pH9 y se centrifuga.
Se elimina el sulfato
de amonio que pudiera quedar por diálisis o columna de Sephadex G-25.
Se mide la cantidad
total de proteínas presentes por Biuret
u otro método.
Se añade el
fluorocromo a baja temperatura y en agitación calculando que debe quedar en una
relación de gamaglobulina: fluorocromo de 100:1.
Se elimina el
colorante no conjugado en columna de Sephadex
G-25.
Se elimina la
fluorescencia inespecífica mediante cromatografía de celulosa.
Comercialmente
se pueden adquirir sueros marcados liofilizados o en solución concentrada que
se diluye según las instrucciones,no obstante conviene titularlos antes de su
uso (se deben enfrentar diferentes diluciones del conjugado con el antígeno
para establecer la mayor dilución en la que se observa mejor la fluorescencia)
METODO DIRECTO
Materiales:
.Preparado con el antígeno ya fijado
.Buffer de lavado y dilución*
.Cámara húmeda
.Recipiente de lavado
.Pipetas Pasteur o micropipetas
.Conjugado específico para el antígeno
(HVB-1, BVDV, PPC etc) en la dilución establecida por la titulación.
.Buffer de montado*
.Cubreobjetos
*Varian con el conjugado utilizado, seguir las
instrucciones que trae.
Procedimiento:
.Se
cubre el preparado con el conjugado en la dilución establecida.
.Se
incuba a 37ºC 45 min. en cámara húmeda o toda la noche a 4ºC
.Se
lava tres veces con buffer de lavado
.Se
monta con buffer de montado y un cubreobjetos
.Se
observa al microscopio de fluorescencia
METODO INDIRECTO
-Materiales
.Preparado con el antígeno ya fijado
.Buffer de lavado y dilución*
.Cámara húmeda
.Recipiente de lavado
.Pipetas Pasteur o micropipetas
.Antisuero específico para el antígeno (HVB-1, BVDV, PPC etc)
en
la dilución establecida por la titulación.
.Buffer de montado*
.Cubreobjetos
*Varian con el conjugado utilizado, seguir las instrucciones que trae.
.
Anticuerpos problema u específicos diluidos 1/5 en buffer de dilución.
Inmunoperoxidasa
La técnica permite la inmunodetección de
antígenos virales presentes en cultivos celulares como también en improntas o
cortes de tejidos de animales infectados.
Este
es un método de coloración indirecta en la que se une primero un suero
específico para el antígeno. Luego una anti-inmunoglobulina de la misma especie
a la que corresponde el primer suero o en su defecto proteína A o G, conjugada
con peroxidasa. Finalmente se coloca un sustrato que da color en presencia de la enzima.
El
mecanismo es igual que para IF con ciertas ventajas:
-La
lectura se efectúa en un microscopio común de campo claro.
-
La preparaciones son permanentes
- Puede tener más sensibilidad cuando se
utiliza la técnica del triple sandwich PAP (avidina -biotina)
METODO
-Fijación
1. Enjuagar suavemente
las células con PBS.
2. Sumergir en un baño
de líquido de fijación, escurrir, y sumergir en un segundo baño durante 5
minutos (las células sobre vidrio deben ser fijadas en acetona pura
y pueden ser coloreadas inmediatamente).
3. Escurrir completamente
.
4. Dejar secar.
La
monocapa celular puede entonces colorearse después de un mínimo de 3 horas o
puede ser guardada despues del secado
en un recipiente o bolsa hermética a -20ºC.
COLORACION
1. Agregar PBS y dejar 5 min.escurrir bien
2. Cubrir
con el antisuero (dilución de uso o como mínimo
1/5) e incubar a 25-37ºC por 15 min.
3. Escurrir
4. Lavar en buffer de lavado acondicionado a temperatura ambiente
3 veces.
5. Escurrir
bien
6. Cubrir
con el conjugado en la dilución establecida en
la titulación previa, incubar a 25-37ºC durante 15 min.
7. Repetir 3
y 4
8. Escurrir
9. Agregar
el sustrato (recién preparado), dejar 15-20
min.a 25-37º.
10. Cuando el
color se haya desarrollado adecuadamente en intensidad, en los controles
escurrir y lavar con buffer de lavado.
El
citoplasma de las células infectadas debe colorearse de un marron rojizo (
usando el sustrato que figura en los reactivos) si el suero posee anticuerpos
para el antígeno en cuestión, en caso contrario se ven de un tono rosa pálido o
incoloras.
REACTIVOS
Buffer fosfato (PBS) ph 7.6 ,0,01 M
Para 4 litros
Na H 2PO4.2H2O
0.8g
Na 2H PO4.2H2O
6.2g
ClNa
34.0g
Solución de acetato de sodio 0.05 M, pH 5
Para 200ml
Acetato de Na
0.58g
Acido Acético
0.18g
Líquido de fijación
Acetona
400ml
PBS
600ml
BSA
200mg
Buffer de lavado
Tween 80
0.5g
PBS 1litro
Buffer de dilución
ClNa
21g
Tween 80
10g
PBS 1 litro
Sustrato
§ 2 mg de 3-amino-9-etil carbazole (SIGMA A 5754) es disuelto en 0.3ml de n,n-dimetil-formamide (SIGMA D 4254). Esta solución stock puede ser hecha en cantidad y guardada a temperatura ambiente
y en oscuridad.
§ Inmediatamente antes de su uso mezclar 0.3ml de la solución
stock con 5ml de la solución de acetato de sodio y agregarle 6 ul de agua
oxigenada al 3% ( el agua oxigenada a niveles mayores puede inhibir la reacción
enzimática)