Curso de Técnicas de Diagnóstico

en Virología Animal

4.- Fijación del complemento al 50%

Instituto de Virología - C.I.C.V. - INTA

FIJACION DE COMPLEMENTO AL 50%

(PARA ENFERMEDADES VESICULARES)

INTRODUCCION

Cuatro son las enfermedades vesiculares que no pueden diferenciarse clínicamente: Fiebre aftosa (FA), enfermedad vesicular del cerdo , estomatitis vesicular, y exantema vesicular. Por lo tanto es necesaria la confirmación de laboratorio.

Por medio de la prueba de fijación de complemento 50% (FC'50) se puede llevar a cabo la detección del antígeno (virus) en el material remitido. Su identificación requiere alrededor de 3 horas.

Se trata de una prueba físico-química en la cual se emplea una batería de sueros hiperinmunes de cobayo, perfectamente estandarizados, que permite tipificar y subtipificar los agentes causantes de las enfermedades vesiculares.

La prueba se realiza en dos etapas:

1. se enfrenta el material sospechoso, adecuadamente procesado, con las diluciones de trabajo de los sueros hiperinmunes específicos y el complemento (C') previamente titulado. Se incuba.

2. se añade el sistema hemolítico, que nos permite visualizar si se produjo la reacción antígeno-complemento.

En los ensayos de FC' es esencial emplear una cantidad limitada y perfectamente regulada de C'. La dosis es específica en términos de unidades de actividad hemolítica. Universalmente se adoptó la normalización del C'en términos de "unidad hemolítica 50% " (UHC'50). Cuando los sueros o los antígenos inactivan el complemento por sí solos, se dice que son anticomplementarios (la actividad pro-complementaria no es usual en materiales infecciosos).

PREPARACION Y STANDARIZACION DE REACTIVOS

1-Sistema hemolítico

A- Glóbulos rojos de carnero

Sangrar el ovino por la vena yugular, usando trócar de 2 a 3 mm. de diámetro o una aguja número 16. Recoger en un volumen igual de solución de Alsever modificada (ver apéndice) . Conservar la mezcla entre 2° y 5° C.

B- Preparación del suero hemolítico o hemolisina en conejo.

Sangrar varios carneros y hacer una mezcla de 300 ml. de sangre

Mezclar con 30 ml. de agua destilada en un frasco de boca ancha y agitar bien.

Centrifugar a 10.000 rpm durante 10-15 minutos. Decantar el sobrenadante cuidando de no arrastrar el estroma.

Continuar lavando con agua destilada hasta que el sobrenadante se aclare.

Resuspender en solución salina fisiológica sin antibióticos, pH 7,6-7,8. Llevar a un volumen igual a la mitad del volumen inicial de sangre.

Seguir el siguiente esquema de inmunización en conejo por vía intramuscular:

1° DIA 2,5 ml.

2° DIA 3 ml.

3° DIA 3,5 ml.

4° DIA 4 ml.

5° DIA 5 ml.

Las inoculaciones se realizan con un intervalo de tres días y se sangra tres días después de la última.

Recoger la sangre en placas de Petri grandes. Dejar una hora a 37°C, cortar el coágulo mantener toda la noche a 4°C.

Centrifugar el suero obtenido 10 minutos a 500 g. Inactivar 30 minutos a 56°C.

Fraccionar . Congelar a -20° C y titular una de las alícuotas.

C- Titulación del suero hemolítico (figura l)

Diluir la hemolisina 1/100 en Buffer Barbital (BB): 19,8 ml de buffer + 0,2 ml. de hemolisina.

Diluir la hemolisina 1/1000: 18 ml de BB + 2 ml de hemolisina 1/100.

Preparar una suspensión patronizada de GR al 2% y medir en el espectrofotómetro (0,4 ml. de GR +1,6 ml. de agua destilada).

Seguir el esquema de diluciones de la Fig.2. Incubar 30 minutos a Baño María a 37°C.

Preparar tantas diluciones de C' como diluciones de hemolisina se usaron para preparar los sistemas.

Obtener el título de C' para cada sistema empleado y hacer el gráfico en papel milimetrado.

Colocar en la ordenada los títulos del complemento y en abcisa las diluciones del suero hemolítico.

El título del suero hemolítico ( 1 UH 50%) estará dado por la recíproca de la mayor dilución del suero que produce 50% de hemólisis con la menor cantidad de C' (iniciación de la "meseta o plateau"). Por lo tanto, 1 UH 50 % es la menor cantidad de suero hemolítico a partir de la cual se obtiene una hemólisis constante aumentando la concentración del mismo.

D- Preparación del sistema hemolítico

Filtrar la sangre de ovino (colectada en Alsever) por algodón para eliminar coágulos.

Hacer un primer lavado con solución salina fisiológica y dos con BB. Se centrifuga a 2000 rpm durante 5 minutos.

Hacer un último lavado con BB y centrifugar 10 minutos a 2000 rpm.

Hacer una suspensión al 2% con los GR lavados.

Colocar 1,6 ml. de agua destilada + 0,4 ml. de la suspensión de GR. Ajustar el espectrofotómetro con agua destilada. Se emplea una longitud de onda de 542nm. La densidad óptica (DO) debe estar entre 0,68-0,70. La DO de la suspensión de GR puede ajustarse añadiendo o quitando BB. La fórmula empleada es la siguiente:

Volumen final = Volumen inicial de GR x DO leído

DO deseado

Después de verificar la DO agregar la hemolisina previamente diluída adecuadamente y se dobla el volumen de BB para lograr una concentración del 1%.

Sensibilizar el sistema incubándolo 30 minutos a 37°C en Baño María (BM).

2- COMPLEMENTO

El complemento (C') es una mezcla de sueros de cobayos sanos de más de 500 g de peso. Los cobayos, dejados en ayuno durante toda la noche, se sangran cortando la vena yugular. Se usa hielo seco como anestésico. La sangre se recoge en placas de Petri. Se deja 30 minutos a 37°C en estufa. Se corta el coágulo, se deja 2 horas a 4°C, se pasa a tubos de centrífuga mantenidos en baño de hielo y se centrifuga 20 minutos a 500 g a 4°C. Se decanta el suero. Se envasa inmediatamente, sin diluir (3 ml. por envase) y se conserva a -70°C o con solución de Richardson. El sobrante de C' usado en cada titulación debe desecharse. Las diluciones que se usarán en la prueba de FC' se preparan en el momento con buffer frío y se conservan en hielo mientras se efectúa la prueba. Se debe evitar la agitación excesiva o el "pipeteo" violento, pues son causa de inactivación del C'.

A- Titulación del C'

La C'H ₅₀se define como la cantidad de C' necesaria para lisar el 50% de los eritrocitos sensibilizados.

Diluir el C' a titular 1/10 con BB (colocar todos los reactivos que intervengan en la reacción en bandejas con agua y hielo )

Colocar en una gradilla 2 hileras con 8 tubos de hemólisis cada una.

Cargar los tubos de acuerdo al esquema siguiente:

C' 1/100

C' 1/10

TUBO

TESTIGO

BLANCO

1.10

1.05

1.00

0.95

0.90

0.85

0.90

1.2

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.30

------

0.80

------

Incubar a 37°C, 30 minutos a Baño María.

Centrifugar a 1800 rpm., durante 10 minutos.

Leer en el espectrofotómetro a 540 nm..

Graficar en papel logarítmico y determinar el 1UC'H₅₀

En base a los resultados obtenidos diluir el C' de manera de emplear en la prueba 4 UC'H50.

El C' diluído 1/10 debe mantenerse a 4°C y desecharse al finalizar la prueba.

B- Cobayización del virus y obtención de suero hiperinmune.

Se parte de una cepa patrón de virus aftoso bovino (origen cultivo celular o aislamiento). Se diluye 1/10 y se inocula 0,2 ml. por vía intradérmica en las almohadillas de las patas traseras de cobayos de 500gr. de peso, controlar cada 24 hs. por desarrollo de lesiones se recoge el material en el momento ene que se observan lesiones podales, controlando a las 24-48-72hs. y se realizan pasajes hasta que ocurra la generalización. (Pasaje de virus de las patas y las manos).

Se dice entonces que la cepa está cobayizada y ese material se guarda en un cepario como virus cobayidado.

Inocular con este material 250 cobayos. A las 24 hs. de inoculados se recoge el material (500 patas). Esto servirá para inmunizar posteriormente a los cobayos.

Una vez curadas las manos y patas (aproximadamente 30 días PI), los cobayos se inmunizan con la suspensión de virus en saponina.

C- Preparación de la suspensión viral de descarga

Saponina Baker o similar: 2,5% en B.Borato.

Epitelio plantar: 1/30 en B.Borato

Centrifugar la suspensión de virus cobayizado a 4000 rpm. durante 20 minutos.

Agregar al sobrenadante la solución de saponina 2,5%. pH 7,8 en concentración final de saponina del 0,25%.

Fraccionar en frascos ampolla y conservar a -20°C.

Este material se usará posteriormente para la inmunización de los cobayos.

D- Inmunización de los cobayos

DIA 1 0,5 ml. lateral derecho

DIA 3 0,5 ml. lateral izquierdo

DIA 5 0,5 ml. región dorsal

DIA 7 0,5 ml. región plantar

Las inoculaciones se realizan por vía subcutánea.

A los 4 días de la última inmunización se sangran los cobayos a blanco y se recoge la sangre en placas de Petri (día 40 PI).

Inactivar el suero 30 minutos a 56°C y guardar a -20°C fraccionado. Para titular el suero hiperinmune de cobayo se emplea un virus de cepario tipificado y subtipificado, almacenado a -70°C.

Hacer diluciones del suero hiperinmune de 1/10 a 1/2560 (dil. aritméticas).

Diluir el virus de 1/2 a 1/64

Realizar la titulación en tubos de hemólisis en bloque de acuerdo al diseño de "Titulación de virus".

El título está dado por la máxima dilución de suero hiperinmune con la que se obtiene el máximo título de antígeno. La dilución de uso se determina dividiendo este valor entre 3, para cubrir deficiencias de antígeno.

3- DESARROLLO DE LA PRUEBA

A- Tipificación de materiales infecciosos

Son normalmente epitelios obtenidos de lesiones linguales, bucales o podales, o bien ratones lactantes inoculados con el virus problema. Se sigue el mismo procedimiento para todos estos materiales.

B- Procesamiento del antígeno

Es el mismo procedimiento para ratones lactantes, epitelio lingual bovino, epitelio plantar de cobayo, etc.

Ratones lactantes: quitar la cabeza, vísceras (menos corazón) y la parte exterior de las extremidades.

Triturar y macerar el resto (aprox. 1 g.) agregando 3 gotas de cloroformo por ratón, hasta obtener una papilla blancuzca.

Agregar 4 ml. de BB por ratón.

Inactivar el macerado a 56°C por 30 minutos en BM y centrifugar a 3000 rpm. , 30 minutos.

Pipetear cuidadosamente el sobrenadante y tipificar enfrentándolo a sueros hiperinmunes de cobayo (previamente titulados y diluídos) tipo A, O y C, etc, de acuerdo al siguiente esquema:

VIRUS

TUBO

Suero

0,4

Suero

0,3

0,4

0,8

1,2

Suero

0,4

Incubar 30 minutos a 37°C en BM.

Agregar 0,8 ml. de SH a todos los tubos

Incubar a 37°C, 30 minutos, agitando la gradilla a los 15 minutos.

Centrifugar a 500 g durante 10 minutos.

Determinar el tipo de virus por observación directa y en caso de dudas se lee en el espectrofotómetro.

Para la tipificación en microplaca se utilizan los mismos reactivos que para la tipificación en tubos, la diferencia reside en que cada 0,4 ml. es reemplazado por una gota de 0,025 añadida con micropipeta.

Se realizan los mismos controles que para la tipificación en tubos.

C- Titulación de un antígeno producido en células BHK-21

Diluir el AG a titular de puro a 1/64

Hacer la prueba siguiendo el esquema:

Dilución del antígeno

1/2

1/4

1/8

1/16

1/64

Antígeno

0,4

Suero homólogo

0,4

Complemento

0,4

Incubar 90 minutos en Baño María a 37°C.

Agregar 0,8 ml. de SH a todos los tubos.

Incubar 30 minutos a Baño María a 37°C

Centrifugar 10 minutos a 500 g

Determinar el porcentaje de hemólisis en cada tubo.

Determinar el título por interpolación del 50% de hemólisis.

CONTROLES

Ag con C'

Ag sin C'

Suero

0,4

0,8

0,4

1,2

0,8

Suero

0,4

D- Subtipificación

Se parte de un virus previamente tipificado, por ejemplo: tipo A.

Realizar diluciones de puro a 1/64

Enfrentar cada dilución a los diferentes sueros hiperinmunes de cobayo: A₂₄ (8345), A_10,A₁₉, A₂₄ Cruzeiro, etc

Cargar la prueba siguiendo el mismo esquema que se utiliza para la titulación del antígeno, repitiéndolo tantas veces como sueros se empleen para subtipificar. Los controles son similares a los de una titulación de antígeno.

Incubar 90 minutos a 37°C a BM.

Agregar el sistema hemolítico.

Incubar 30 minutos a 37°C en BM.

Centrifugar y leer en el espectrofotómetro.

Determinar el título del Ag enfrentado a los diferentes sueros . El subtipo del virus estará dado por el suero frente al cual el título es mayor.

BIBLIOGRAFIA

Kabat y Mayer. l97l. "Experimental immunochemistry". 2nd Ed. Charles C. Thomas, Publisher, Springfield 11. 133-240