5.-    Pruebas Inmunoenzimáticas

(ELISA)

Instituto de Virología - C.I.C.V. - INTA

ELISA

OBJETIVO DE LA TECNICA

Determinar antígeno (Ag) o anticuerpo(Ac) en forma sensible y objetiva.

INTRODUCCION

Para cuantificar pequeñas cantidades de Ag o Ac no detectables por los métodos convencionales pueden aplicarse técnicas que utilizan marcadores de alta sensibilidad. El ELISA se basa en la utilización de superficies sólidas para inmovilizar Ag o Ac, en la elusión a través de lavados de los reactivos que no reaccionan y en la detección de la reacción a través de conjugados enzimáticos.

Las enzimas pueden unirse a Ag, Ac u otras proteinas y los conjugados resultantes conservan tanto la actividad enzimática como inmunológica. La degradación enzimática de un sustrato cromógeno soluble brinda un factor de amplificación que facilita la detección sensible, precisa y cuantificable de las reacciones Ag-Ac.

Ventajas

-Los reactivos marcados con enzima son de alta estabilidad.

-Permite una completa automatización.

-Los resultados son objetivos y pueden ser cuantificados por un  espectrofotómetro.

-Los Ag o Ac marcados con enzima pueden ser manejados en condiciones normales de laboratorio.

Desventajas

-Diferente afinidad de los Ag para adherirse a la fase sólida

-Presencia de reacciones no específicas.

TIPOS DE ENSAYO:

Para medicion de antigeno                          Para medición de anticuerpo

    Competitivo                                               Competitivo

    Sandwich                        `                         Indirecto (Figura 2)

    Sandwich indirecto (Figura 1)                  Sandwich indirecto

BIBLIOGRAFIA

Afshar , A., Shakarchi,N.H. and Dulac,G.(1993) Development of a competitive Enzyme-linked immmunosorbent assay for detection of bovine, ovine, porcine and equine antibodies to vesicular stomatitis virus. J.Clin Microbiol.31: 1860-1865.

Afshar,A., H.C. Trotter, G.C. Dulac, J.J. Reddington.(1993) Evaluation of a commercial competitive ELISA test kit for the detection of group-specific antibodies to bluetongue virus.

J Vet Diagn Invest 5: 336-340

Hamblin,C., Barnett,I.T.R. and Hedger, R.S.(1986) Anew enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus.I.Development and method of ELISA. J.Immunol.Meth..93 :115-121

Horner,G.W. and  Orr,D.M. (1993) An enzyme-linked immunosorbent assay for detection  of antibodies against bovine pestivirus. New Zealand Vet.Jour. 41:123-125.

Kramps, J.A., Quak,S., Weerdmeester,K. and van Oirschot J.T.(1993)  Comparative study on sixteen enzyme-linked immunosorbent assays for the deteection of antibbodiess tto bovine herpesvirus 1 in cattle. Vet.Microbiol., 35: 11-21.

PRACTICA: ELISA INDIRECTO PARA DETECCION DE ANTICUERPOS ANTI-BHV-1

EQUIPOS , MATERIALES Y SOLUCIONES

      Lector de microplacas. Filtro 492 nm.

      Microplacas de 96 pocillos  Immulon 1 (Dynatech Lab, USA, Cat No 011-010-3455)

      Ovoalbumina (Fluka Biochemika, Switzerland, Cat No 05461 ) . Conservar a + 4^oC.

      Tween 20 (Polioxietilen sorbitano monolaurate).

      Conjugado anti-bovino peroxidasa  (Dako Corporation Cat No P    ) . Diluído 1/2 en glicerol y conservado a -20^oC.

      Peróxido de hidrógeno. Conservar  a + 4^oC protegido de la luz.

Materiales

a) Antígeno positivo o infectante. Preparado con cepas de referencia y titulado.

Antígeno control o negativo. Preparado a partir de cultivos celulares no infectados y titulado.

b) Suero: Problema, control positivo y negativo diluídos en PBST-OVA.

c) Conjugado. Anti-gamaglobulina bovina marcada con peroxidasa conservada en forma concetrada y titulada.

d) Microplacas. Dynatech INMUNOLON I o NUNC cod. 2-69620.

e) Soluciones. PBST, PBST-OVA, Buffer carbonato-bicarbonato, ABTS, H202 3%.

f) Otros materiales. Micropipetas, tips, gradillas, tubos eppendorf etc.

Producción del Antígeno.

a) Se infectan frascos rollers de TFB o MDBK de 24 horas con virus BHV-1 a una m.o.i.= 0,1; otros frascos se inoculan con PBS. Luego de 45 minutos de adsorción se le agrega  medio de mantenimiento sin suero.

b) Se cosecha cuando el efecto citopático es confluente, agitando para levantar las células.

c) Se congela y descongela 3 veces.

d) Se centrifuga a 10000 rpm, a 4 C, 30 minutos y se descarta el sedimento.

e) Se ultracentrifuga el sobrenadante  a 4 C, 40000 rpm, 60 minutos y se conserva el sedimento.

f) Los pellets se resuspenden en buffer NET ( 0,3 ml aprox. por tubo, luego se lavan con 0,5 ml todos los tubos ) con pipeta pasteur y jeringa con aguja intradérmica.

g) Se clarifica 2 minutos a 10000 rpm.

h) Se fracciona y conserva a -70 C.

i) El mismo procedimiento se sigue para las células no infectadas.

Titulación del Antígeno

a) Se efectúan diluciones del antígeno control ( células no infectadas ) y del positivo ( células infectadas con el virus ) en buffer carbonato-bicarbonato ph=9,6.

b) Se realiza un ELISA enfrentando diluciones de antígeno control ( Ag - ) y del Ag+ ( diluciones dobles a partir de 1/10 ) a diluciones de sueros controles negativos y positivos conocidos ( cuadruples partiendo de 1/40 ).

c) La máxima dilución de antígeno que otorga mayores diferencias entre Ag+ menos Ag- para el suero positivo y en donde las diferencias son nulas para el suero negativo se fijará como título.

Metodología

a.   Sensibilización de la placa

     Diluir,el Ag+ y el Ag- en buffer carbonato, de acuerdo a lo establecido en la titulación. 

     Depositar 50 ul de Ag- y Ag+ en pocillos impares y pares respectivamente . Homogeneizar bien antes de sembrar.

     Incubar la placa tapada toda la noche a 4 C.

     Descartar el Ag excedente y secar sobre papel absorvente.

     Lavar 3 veces con PBS-T.

b.   Bloqueo

     Depositar 75 ul de buffer de bloqueo por pocillo.

     Incubar a 37 C, 30 min. con agitación o 60 min. sin agitación.Descartar el buffer y secar con papel absorvente.

c.   Agregado de sueros problema y sueros controles

     Se realizarán diluciones 1/40 de los sueros problema y sueros controles positivo y negativo en PBST-OVA.

     Si se requiere una determinación cuantitativa se realizarán diluciones cuadruples a partir de 1/40 (p.ej. 1/160, 1/640, 1/2560)

     Se colocará 50 ul de cada suero en pocillo con Ag- y Ag+ .

     Incubar a 37 C 30min. con agitación o 60 min. sin la  misma.

     Lavar 3 veces con buffer de lavado. 

d.   Agregado del conjugado

     Depositar 50 ul de conjugado, diluido de acuerdo al título (en PBST-OVA)  en todos los pocillos.

     Incubar a 37 C, 30 min. con agitación o 60 sin la misma.

     Lavar 5 veces con PBST.

e.   Agregado del sustrato

     Disolver 300 ul de ABTS en 12 ml de buffer citrato, una  vez disuelto agregar 60 ul de H2O2 al 3%.

     Depositar 100 ul en todos los pocillos.

     Leer a los 20 min. sin frenar la reacción.

f.    Lectura visual

     Se registra la validéz de la prueba observando los controles.

     Control positivo: La intensidad de color en el pocillo con  Ag+ deberá ser superior a la del pocillo con Ag-.

     Control negativo: Las intensidades deberán ser iguales, a  veces es superior la del pocillo con Ag-.

     Una muestra es positiva cuando las diferencias que se  presentan entre Ag+ y Ag- son visibles.

     Una muestra es negativa cuando al comparar dichos pocillos no hay diferencias, o cuando el Ag- diera más intensidad de color que el Ag+.

     Una muestra es dudosa cuando las diferencias son mínimas entre los pocillos. En este caso dosar el suero por otra técnica (IFI o SN).

g.   Lectura espectrofotométrica ( a 410 nm)

     Se calcula para cada suero la densidad óptica (DO) corregida (DO Ag+ menos Ag-).

     Una muestra es positiva cuando la DO corregida es = o > a 0,20.

     Una muestra es negativa cuando la DO corregida es inferior a 0,15.

     Una muestra es dudosa cuando la DO corregida esta entre 0,15 y 0,20.c

h.   Determinación cuantitativa

     Lectura visual: el punto final es la máxima dilución de suero que presenta diferencias visibles entre Ag+ y Ag-.

     Lectura espectrofotométrica: el punto final es la máxima dilución de suero cuya DO corregida es = o > a 0,11.

Soluciones

-Buffer NET

Trizma base                             1,514 g

ClNa   0,12 M                           1,753 g

EDTA   0,01 M                           0,931 g

H Cl   1 N                              7,5 ml

H2O dest. c.s.p.                      250   ml

-Buffer carbonato-bicarbonato PH 9,6

Carbonato disódico (CO3Na2)             0,159 g

Carbonato monosódico (CO3HNa            0,293 g

Agua destilada c.s.p.                   100  ml

-Buffer de lavado - PBS- Tween 20- 1X (PBST)

Se prepara PBS 10X

ClNa                80 g

KH2PO4               2 g

Na2HPO 12H2O        29 g

KCl                  2 g

H2O dest. c.s.p.  1000 ml

A esta solución se le agrega ( a temp. ambiente y bajo agitación permanente ) 5 ml de Tween 20. Conservar a 4 C por poco tiempo ( no más de un mes ). Para su uso diluir 100 ml de PBST 10X con 900 ml de H2O destilada, ajustar el ph a 7.4-7.6 con OHNa 1 N.

-Buffer de Bloqueo

PBST 1X              99 ml

Ovoalbúmina (OVA)     1 ml

Buffer sustrato  ABTS 40 mM

Solución madre: 0.22 g ABTS

                10 ml buffer citrato

                Guardar a 4 C en frasco de color caramelo

Solución de uso: 150 ul solución madre

                 + 6 ml buffer citrato

                 + 30 ul H2O2 3 %.

-Buffer citrato

ph= 5

0.96 g ácido cítrico

Agregar 90 ml de H2O bidestilada

Ajustar con OHNa 1 N a ph 5 (+ o - 10 ml)

ELISA sandwich-antiglobulina para ensayo de antigeno

ELISA indirecto para determinacion de anticuerpo