Curso de Técnicas de Diagnóstico

en Virología Animal

6.- Inmunodifusion

Instituto de Virología - C.I.C.V. - INTA

INMUNODIFUSION EN GEL DE AGAR

INTRODUCCION

Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con el antígeno correspondiente, se forman complejos antígeno-anticuerpo que se insolubilizan en su mayor parte, dando lugar a una reacción de precipitación.

Empleando soportes adecuados es posible que los antígenos y anticuerpos migren con diferentes velocidades, de modo que al encontrarse interreaccionen y precipiten. Los geles utilizados como soporte tienen como base pectina, alginatos, poliacrilamida e incluso pueden utilizarse tiras de acetato de celulosa gelatinizado. Los precipitados que se originan se visualizan como bandas, que permanecerán estables mientras un mayor flujo de moléculas de alguno de los reactivos empleados no provoque su redisolución.

Se utiliza normalmente el método de Oucherlony o de doble difusión. Consiste en enfrentar en pequeñas perforaciones efectuadas en el agar, las soluciones de antígeno y anticuerpo. Al difundir y ponerse en contacto, producirán una banda de precipitación sólo si se encuentran en concentraciones óptimas. Si ésta concentración es la que corresponde a la zona de equivalencia de la banda de precipitación estará situada aproximadamente en la distancia media que separa los reservorios. Cuando hay exceso de antígeno o anticuerpo, la banda estará más próxima al pocillo del anticuerpo o del antígeno, respectivamente. (Fig. 1)

Este sistema permite identificar las bandas de precipitación mediante el empleo simultáneo de antígenos y anticuerpos conocidos.

Se pueden observar tres tipos de reacciones (Fig. 2):

a. Reacción de identidad: los dos sistemas difunden en una única banda de precipitación.

b. Reacción de no identidad: cada sistema reacciona independientemente, originando bandas de precipitación que se cruzan.

c. Reacción de identidad parcial: Se produce cuando uno de los antígenos tiene menos de un componente y es capaz de dar una reacción cruzada con un anticuerpo elaborado contra un antígeno más simple. En este caso las bandas de ambos sistemas se unen y funden parcialmente en una banda, apareciendo una prolongación o espolón. Esto indica que en este antígeno hay componentes antigénicos no compartidos.

Este método, que debido a su sencillez, se puede realizar en cualquier laboratorio, ha sido utilizado prácticamente en todas las virosis,. como método de diagnóstico serológico. Debido a su limitante, la baja sensibilidad, ha sido desplazado por otras técnicas.

En virología veterinaria se lo utiliza en la actualidad para identificar reactores para las siguientes infecciones: Fiebre aftosa, Leucosis Bovina Enzoótica, Lengua Azul, Anemia Infecciosa Equina, Enfermedad de Gumboro, Bronquitis Infecciosa.

TECNICA DE INMUNODIFUSION EN AGAR PARA LEUCOSIS BOVINA ENZOOTICA

Materiales

a. Agar: Buffer Tris 0,05 M PH 8, CINa 8,5%, Agar Noble 0,85%.

b. Antígeno y antisuero control.

c. Sueros problema.

d. Otros: Portaobjetos

Pipetas

Cámara húmeda.

Método

a. Preparación del agar:

Disolver a Baño María hasta que se vea transparente. Colocar 3,5ml. sobre un portaobjeto limpio y desengrasado. Dejar enfriar en un ambiente libre de polvo o tapado hasta que solidifique bien. Una vez solidificado conservar tapado y a 4ºC hasta su uso. Perforar usando el sacabocado convencional que indique el kit,de 7 bocas (una central y 6 periféricas). Extraer el agar de los pocillos con bomba de vacio.

b. Siembra

Colocar el suero positivo de referencia en 3 de los pocillos periféricos en forma alternada. Colocar luego los sueros problema en los orificios restantes. Llenar los pocillos hasta la superficie, sin dejar menisco (aproximadamente 25 ul.).

Colocar el antígeno en el pocillo central de la misma manera.

Incubar a temperatura ambiente (20 - 25º), en cámara húmeda durante 48 horas.

c. Interpretación de resultados

Usar una fuente de iluminación que provea y que incida en forma oblicua al plano inferior de la placa.

Negativo (reaccion de no identidad): La línea control continúa hasta el pocillo del suero problema.

Positivo (reacción de identidad): La línea control se une en forma ontinúa con la línea producida por el suero problema.

Inespecífico: La línea del suero problema se cruza con la línea control.

Positivo o débil: La línea control se curva ligeramente pero no alcanza a formar una línea completa entre el suero problema y el antígeno.

BIBLIOGRAFIA

Morilla, A., Bautista, C., 1986. Manual de Inmunología pag. 51 - 62.

Alonso et al. 1992. Manual dediagnóstico de la boratorio de las enfermedades vesiculares.

O.I.E. 1991. Manual of recommended diagnostic techniques and requirements for biological products.