8.-    Titulación Viral por el Método

del Punto Final 50%.

Instituto de Virología - C.I.C.V. - INTA

TITULACION de VIRUS

1.- Introducción

"Titular" una preparación de ácido, base, anticuerpo, antígeno, significa determinar la cantidad del elemento en cuestión que esa preparación contiene. Lo mismo se aplica en el caso de las preparaciones virales.

Para preparar los sustratos celulares infectados para inmunofluorescencia, ELISA, inmunoperoxidasa o hibridización es necesario conocer la cantidad de virus conque se trabaja, es decir el "título" de la suspensión viral. Esto es así porque para que una infección viral sea eficiente se debe trabajar con determinada "multiplicidad de infección" (m.i.), que se define como la cantidad de virus inoculado por célula del cultivo celular. La obtención de resultados reproducibles depende del control de todos los elementos que intervienen en el ensayo, y la m.i. es uno de ellos, que debe definirse para cada procedimiento.

Además, en ciertos casos de aislamiento viral puede resultar importante conocer cuál es la cantidad de virus aislada.

2.- Conteo de partículas virales

Para determinar la cantidad de virus en un material puede recurrirse al conteo directo de partículas virales aplicando técnicas de microscopía electrónica. Este método es técnicamente complejo y tiene la grave desventaja de no considerar la actividad biológica de las partículas virales.

Qué significa ésto? Un virus es una partícula macromolecular que se detecta debido a su actividad biológica, que se manifiesta cuando la partícula infecta un huésped susceptible. La visualización de esa actividad puede consistir en la observación de efecto citopático (ECP), o formación de sincicios o tumores en un cultivo celular, formación de pústulas en la membrana corioalantoidea o muerte de un embrión de pollo, muerte o enfermedad de un animal de experimentación. Desde el punto de vista biológico lo que interesa es la expresión de la actividad biológica (o infectiva) de la partícula viral, ya que existen partículas virales que por defectos en su material genético u otro tipo de alteraciones en su estructura no son infectivas, es decir no tienen actividad biológica. Estas partículas están presentes en todas las preparaciones virales, en cantidades variables (1).

Para fines diagnósticos propiamente dichos, o para la preparación de reactivos para diagnóstico, lo que interesa cuantificar es la capacidad infectiva del virus, para lo cual no es adecuado el conteo de partículas por microscopía electrónica. Debe observarse  el efecto que el virus produce en el huésped inoculado. Si se observa un solo “ejemplar” de huésped, el efecto o respuesta es de "todo o nada", es una respuesta negativa o positiva. Por ej.: hay efecto citopático o no lo hay; el animal de experimentación muere o sobrevive, aparecen pústulas en el embrión de pollo o no. Para poder hacer una cuantificación deben utilizarse varias réplicas del huésped elegido (cultivos celulares, animales, huevos embrionados). Cada réplica se denomina "unidad de prueba". Cuanto mayor es el número de unidades de prueba, más precisa resulta la determinación.

3.- Método de Titulación por el Punto Final

3.1.- Curva Dosis-Respuesta

Si se grafica "Efecto viral" versus "cantidad de virus" se obtiene una curva sigmoidea, "Dosis- Respuesta" clásica (Fig. 1). Por esta razón la forma habitual y más sencilla de expresar títulos virales es según el número de dosis presentes en la muestra. La "respuesta" se mide como "porcentaje de efecto", siendo el efecto cualquiera de los mencionados anteriormente, según el virus y el huésped. La "Dosis" se expresa como dilución de la muestra viral. En general se usan diluciones al décimo, y se trabaja con el log₁₀ de las diluciones.

Puede expresarse el título como Dosis Infecciosa Máxima o Dosis Infecciosa Mínima. En los casos en que la infectividad se evidencia por la muerte de animales de laboratorio la denominación es Dosis Letal Máxima o Mínima respectivamente.

Fig. 1. Curva “Dosis- Respuesta”

Observando  en la Fig. 1 la forma de la curva "Dosis-Respuesta"-- en nuestros términos "Porcentaje de Efecto-Dilución de muestra" -- vemos que en las zonas de efecto máximo y mínimo no puede asignarse unívocamente un "Porcentaje de Efecto" a una determinada "Dosis o Dilución". Para una determinación precisa debe trabajarse en una zona de diluciones tal que a una pequeña variación en la dilución le corresponda una variación claramente detectable en la respuesta. Por esta razón se elije la zona correspondiente al 50% de efecto, y el título de la muestra se expresa como número de "Dosis Infecciosas 50%" (DI₅₀), que representa la dosis (dilución de muestra) que produce efecto (muerte o enfermedad del animal o embrión, efecto citopático en cultivos celulares) en el 50% de las unidades de prueba. Según el tipo de efecto buscado la DI₅₀ puede expresarse como Dosis Letal 50%, Dosis Infectante de Cultivo de Tejidos 50%, Dosis Infectante de Embriones 50% (DL₅₀, DICT₅₀, DIE₅₀, respectivamente).

3.2.- Método de Reed y Muench

Normalmente el 50% del efecto buscado no corresponde exactamente a una de las diluciones de trabajo, por lo que es necesario hacer una interpolación matemática para definirla. El método  más empleado para este fin es el de Reed y Muench . Se basa en la suposición de que el número de unidades de prueba afectadas varía proporcionalmente al log₁₀ de la dilución, es decir que a diluciones menores (mayor concentración de virus) el porcentaje de efecto será mayor que a diluciones mayores (menor concentración de virus). Además, se supone que en la zona cercana al 50% de Efecto éste varía linealmente con la dosis. Es muy importante no omitir ninguna dilución intermedia.

Ejemplo: Supongamos que se inoculan 6 ratones por dilución y que el efecto buscado es la muerte de los ratones. Se confecciona la siguiente tabla con los resultados (adaptada de (1)):

^*: Muertos/Total

Para obtener las cifras de las columnas "Total Muertos" y "Total Sobrevivientes" se suman las cifras de "Muertos" y "Sobrevivientes" en el sentido de las flechas. Esto se hace así por la suposición antes mencionada de que las concentraciones mayores de virus, por ej. la dilución 1:10, hubieran ejercido su efecto sobre todos los ratones inoculados con las diluciones menores; del mismo modo, las concentraciones menores de virus (dilución 1:100000), nco hubieran hecho efecto sobre los ratones inoculados con las concentraciones mayores.

En el ejemplo no hay ninguna dilución (o log₁₀ dilución) tal que el efecto sea exactamente el 50%, pero vemos que esa dilución estará entre -3 (71% de efecto) y -4 (13% de efecto). Es importante recordar que "50% de efecto", o "Efecto del 50%" ( o cualquier otro porcentaje) significa que el efecto se ejerce sobre el 50% (o el porcentaje que sea) de las unidades de prueba, y que la DI₅₀ es aquella que infecta el 50% de las mismas.

Como se dijo, para establecer ese valor se recurre a una interpolación matemática.

En la Fig. 2 se representa el % de Efecto total(acumulativo) para cada log₁₀ de dilución.

Fig. 2: Porcentaje de Efecto vs. -Log₁₀ dil

Nos interesa averiguar el valor "x", que corresponde al log₁₀ de la dilución correspondiente a la DI₅₀. Esto se hace mediante una fórmula que puede deducirse trabajando con los triángulos semejantes de la Fig. 3.

Fig. 3

Los triángulos ABC y AED son semejantes, por lo que sus lados homólogos son proporcionales.

    Es decir:                          AB  BC

                                           AE   ED

                           AB= 71-13                 BC=-3-(-4)

                           AE= 71-50                 ED= -3-x

    Reemplazando:            71-13  -3-(-4)

                                          71-50  -3-x

   El valor de "x" se obtiene por trasposición de términos:

                          x = -3- 71-50  [-3-(-4)]

                                       71-13

    El factor [-3-(-4)]= 1 es constante para todos los casos en que se usan diluciones al décimo. Corresponde al log₁₀ del factor de dilución.

    Generalizando, es

              x= log₁₀ (dilución que da > 50%) + %>50 - 50%

                                                                   %>50 - %<50

Resolviendo resulta         log₁₀ DI₅₀= x=-3,36

Esto significa que en una dilución 1: 10^{3,36 del material original hay 1 DI}₅₀.

Por lo tanto, en el material original, sin diluir, hay 10^3,36 DI₅₀, que se expresan por unidad de peso o de volumen de la muestra. El título viral de la misma será

                          10^3,36 DI₅₀/ml     o        10^3,36 DI₅₀/g.

4.      Método de Plaqueo

Este método se desarrolló con posterioridad al anterior, y es mucho más preciso. Consiste en infectar un cultivo celular y agregar el medio nutritivo del mismo en fase semisólida (agar, agarosa, carboximetilcelulosa, metilcelulosa). De esta manera, cuando un virus infecta una célula, su progenie sólo puede migrar a las células inmediatamente vecinas,  y no a las alejadas, ya que el medio semisólido limita su movilidad. Coloreando las células se observarán zonas no teñidas (placas de lisis), correspondientes a las células destruídas por la partícula infecciosa inoculada y las nuevas partículas que ella produjo (Fig.4). si la coloración se realiza con un colorante vital (rojo neutro), que no mata las células teñidas ni al virus, es posible tomar material de una placa, que contendrá la progenie viral correspondiente a un único virus infectante, constituyendo, por lo tanto, un “clon”.

En este caso, la curva "Dosis-Respuesta" es lineal (Fig.5), indicando que a cada placa de lisis corresponde una única partícula infectante. Por esta razón el método es mucho más preciso que el descripto anteriormente, ya que el margen de error es menor. Se calcula que para igualar la precisión que se logra contando 100 placas de lisis, en el método del punto final debería trabajarse inoculando 100 unidades de prueba por dilución.

Fig. 5: Curva “Dosis-respuesta” del método de plaqueo.

El título de la preparación viral se calcula contando el número de placas que produce una determinada dilución de la muestra, y haciendo las correcciones necesarias para llegar a la cantidad de virus en la muestra original. Cada partícula infecciosa da origen a una placa de lisis, y se denomina en este caso "Unidad Formadora de Placa" (UFP). El título se expresa como "UFP/ml" o "UFP/g", según corresponda.

Por ejemplo: Supongamos que la inoculación de 0,2 ml de una dilución 1:1000 de una suspensión viral produce 84 placas de lisis en un cultivo celular. Esto es equivalente a decir que en ese volumen de esa dilución hay 84 UFP. Debemos expresar el título en "UFP/ml".

                             0,2 ml = 84 UFP

                               1 ml = (84 UFP x 1 ml): 0,2 ml= 420 UFP

Son 420 UFP/ml en la muestra diluída 1:1000, por lo tanto la muestra original tiene

                                          420 x 1000 UFP/ml.

En notación científica:

                                          4,2 x 10⁵ UFP/ml.

5.- Expresión de la multiplicidad de infección

Volvemos ahora a la definición de "multiplicidad de infección", (m.i.), que mencionamos al principio. Se define como la cantidad de virus inoculada por cada célula. Si, por ej., para

preparar células infectadas para inmunofluorescencia se indica que debe ser m.i.=0,1, debe aclararse si se trata de 0,1 DI₅₀/célula, ó 0,1 UFP/célula. De esta manera titularemos nuestra el virus a usar por el método que corresponda. Para la preparación de reactivos para diagnóstico comunes es suficiente con determinar  el título en DI₅₀. En general se trabaja con DICT₅₀.

1.- "Microbiology". Davis, Dulbecco, Eisen, Ginsberg; p.789. 4º Edición. J.B. Lippincott Company, Filadelfia, 1990.